MoneyMan

Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9

Рис. 1. Хотя методы редактирования генома активно используются уже несколько лет, у них остается много недостатков. В новом методе, предложенном учеными из Гарвардского университета, белок Cas9 работает совместно с обратной транскриптазой, а в ДНК делаются только однонитевые разрезы, что существенно снижает риск ошибки. Рисунок с сайта news.harvard.edu

Ученые из Гарварда, уже несколько лет развивающие методы редактирования генома, опубликовали описание нового подхода, который позволяет делать любые однонуклеотидные замены и более крупные вставки и делеции, но отличается от классического CRISPR/Cas9-редактирования большей аккуратностью. Это стало возможным благодаря тому, что новый редактор обходится без двухцепочечных разрезов ДНК и самостоятельно достраивает редактируемую цепь. В результате количество ошибок у него ниже, а эффективность — выше.

В последние годы технологии геномного редактирования на основе белкового комплекса CRISPR/Cas9 прочно вошли в инструментарий молекулярных биологов. С их помощью можно вносить нужные изменения в нужное место генома — и эта возможность оказалась невероятно востребована. Технологии CRISPR/Cas9 нашлось множество применений, так что в итоге она стала восприниматься чем-то вроде швейцарского ножа, которым пытаются сделать все, что угодно: предотвращать наследственные заболевания и ВИЧ (см. статьи Исправленные дети и Исправленная редакция), создавать организмы с суперспособностями (M. Karageorgi et al., 2019. Genome editing retraces the evolution of toxin resistance in the monarch butterfly), следить за судьбой отдельных клеток при развитии (R. Kalhor et al., 2018. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR) и даже управлять гидрогелем (M. A. English et al., 2019. Programmable CRISPR-responsive smart materials).

Несмотря на бешеную популярность у исследователей, этот метод имеет свои ограничения. Из-за них ученые не спешат переходить от опытов на животных к редактированию человеческих геномов, а единичные случаи таких процедур встречаются неоднозначно (см. статью В режиме редактирования). Два основных риска, которые сопровождают применение CRISPR/Cas9 — не отредактировать ничего и отредактировать не то. Так, первый и единственный на сегодняшний момент китайский эксперимент по редактированию нормальных эмбрионов оказался, судя по короткой презентации его автора, не очень успешен: редактирование произошло не во всех клетках и не каждой из двух клеточных копий ДНК, а также обнаружились неправильно отредактированные участки ДНК. Другие, более открытые исследования на забракованных эмбрионах говорят об успешном редактировании примерно в двадцати процентах случаев (P. Liang et al., 2017. Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos).

Решение указанных проблем существенно продвинуло бы эту и без того популярную технологию вперед и сделало бы ее потенциальное применение в медицине более безопасным и оправданным. На сегодняшний день есть уже много модификаций классической CRISPR/Cas9-системы, которые помогают снизить риски, но пока ни одна из них не преодолела их полностью.

Один из основных недостатков классического метода — в нем используются разрывы обеих нитей ДНК. В системе CRISPR/Cas9 три основных компонента: направляющая РНК (single-guide RNA, sgRNA) с куском, комплементарным редактируемому участку, образец того, на что надо заменить этот участок и собственно белок Cas9. Сперва sgRNA связывается с ДНК, а следом фермент Cas9 находит этот комплекс и делает на его месте двухцепочечный разрез ДНК. Для клетки двухцепочечные разрывы опасны и она старается их максимально быстро «зашить». Если вовремя подсунуть ей образец, по которому это нужно сделать, система репарации починит разрыв по этому лекалу. Но починка двухцепочечных разрывов не всегда происходит аккуратно, так что их появление в ходе CRISPR/Cas9-редактирования связано с риском ошибок и большим количеством брака.

В 2017 году Дэвид Лиу (David Liu) и его коллеги из Гарвардского университета предложили альтернативный метод — так называемое «редактирование оснований» (base editing). В его основу легло использование гибридного фермента, сшитого из мутантного белка Cas9, который умеет резать только одну цепочку ДНК, и фермента, модифицирующего основания. Интересно, что этот фермент был создан в лаборатории при помощи искусственной эволюции. Подробно о том, как это было сделано, можно прочитать в новости Методом искусственной эволюции создан новый фермент для редактирования геномов («Элементы», 31.10.2017). Этим методом можно аккуратно делать четыре типа точечных замен нуклеотидов (C→T, G→A, A→G, T→C), но для других операций с ДНК он не годится.

В новой работе, опубликованной на днях в журнале Nature сотрудниками той же лаборатории, предлагается продвинутый способ редактирования геномов — теперь можно менять довольно крупные участки ДНК, не создавая при этом двухнитевых разрывов. Это стало возможным благодаря нескольким изменениям существующих систем редактирования генома.

Во-первых, образцы редактируемого участка «как есть» и «как надо» теперь объединены в одну РНК, которую назвали prime editing extended guide RNA (pegRNA). Сам белок, нареченный праймирующим редактором (prime editor, PE), тоже модифицирован и состоит из двух частей (рис. 2): мутантной версии белка Cas9, способной расплести ДНК и сделать надрез на одной цепи, и пришитой к нему обратной транскриптазы, позволяющей гибридному ферменту синтезировать ДНК на основании матрицы pegRNA.

Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9
Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9

Рис. 2. a — раньше при помощи «редактирования оснований» можно было аккуратно починить порядка 30% известных вредных мутаций, а именно — любые транзиции. Новый метод в теории позволяет проделать это для любых модификаций в пределах 30 нуклеотидов, то есть в 89% случаев. b — комплекс PE состоит из куска белка Cas9, делающего единичный надрез на ДНК, и домена обратной транскриптазы, способной синтезировать ДНК по матрице РНК. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Весь механизм работы нового метода разбивается на несколько этапов, схематично показанных на рис. 3.

Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9
Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9

Рис. 3. Этапы работы комплекса PE с нитью ДНК. Пояснения в тексте. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Для начала pegRNA и PE должны образовать комплекс с редактируемым участком ДНК. Это происходит примерно так же, как обычно: гомологичный участок pegRNA (зеленый на рис. 3) находит и связывает ДНК с мутантным доменом Cas9 (лиловый), который делает надрез (в «классическом» варианте CRISPR/Cas9 эту функцию выполняет sgRNA).

На следующей стадии вступает кусок pegRNA, содержащий исправленную версию редактируемого участка. Он связывается с незанятым разрезанным участком ДНК. Важно, что получившаяся гибридная молекула «РНК+ДНК» может служить затравкой для работы обратной транскриптазы.

Наконец, домен обратной транскриптазы (оранжевый кусок PE) достраивает хвостик ДНК по правильной матрице pegRNA.

В итоге, после диссоциации белков и РНК, остается ДНК с одноцепочечным разрывом и двумя хвостами, один из которых содержит исходную, а другой отредактированную версию последовательности (рис. 4). Клеточные системы починки ДНК должны выбрать одну из них для того, чтобы восстановить целостность ДНК. По идее это должна быть исходная версия, полностью комплементарная целой цепочке, но несмотря на это, за основу часто выбирается отредактированный кусок. Причина в том, что исходный кусок больше подвержен действию эндонуклеазы FEN1, которая охотится за 5′-хвостами ДНК и разрушает их.

Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9
Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9

Рис. 4. Два варианта развития событий после этапа синтеза ДНК. В первом случае (вверху) клетка считает свежесинтезированную цепь неправильной и восстанавливает исходную последовательность. Во втором случае (внизу), благодаря работе эндонуклеазы FEN1 и коварно надрезанной противоположной цепи ДНК, клетку убеждают в «правильности» новой цепи, и она исправляет все по ее лекалу. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

На этом редактирование не заканчивается. Хотя разрыв успешно зашит, все равно остается вторая цепь ДНК, в которой не происходило никаких изменений с самого начала эксперимента. Получается, что две цепи ДНК не полностью комплементарны друг другу, и снова система починки клеточной ДНК должна это исправить. А для этого она должна решить, какую именно цепь взять за образец. Чтобы сместить выбор в пользу отредактированной цепи, исследователи предлагают повторять первый шаг процесса: снова сделать надрез на ДНК, но уже на противоположной цепи. Эта искусственная поломка позволяет перехитрить клетку и убедить ее, что правильная цепь — отредактированная.

Все три этапа редактирования — разрезание ДНК, ее достраивание и починка клеткой — могут сопровождаться ошибками. Чтобы доказать эффективность новой методики, Лиу и его коллеги провели более 175 операций по редактированию генома. Для примера они починили клетки из культуры с мутациями, вызывающими у людей разные заболевания, среди которых серповидноклеточная анемия (требуется замена одного нуклеотида в гене HBB) и болезнь Тея-Сакса (необходимо удалить целых четыре нуклеотида в гене HEXA). Кроме того, они модернизировали клетки, заменив одно пуриновое основание на пиримидиновое в гене PRNP и обезопасив их тем самым от связанных с этим геном прионных заболеваний.

Авторы сравнили новый метод со старыми: «редактированием оснований» и классическим CRISPR/Cas9 (рис. 5). «Редактирование оснований» оказалось более аккуратным при простых заменах, но в более трудных случаях, когда рядом с заменяемым основанием расположено много таких же, оно сбоило чаще, чем новый метод. CRISPR/Cas9 проиграл ему «по всем статьям». На примере редактирования разных клеточных линий авторы показали, что эффективность нового метода достигает 20–50%, а количество ошибок колеблется в пределах 10%. CRISPR/Cas9-правильно срабатывало лишь в 3–20% случаев.

Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9

Рис. 5. Сравнение эффективности комплекса PE (вверху) и редактирования с двухцепочечными разрывами. Синим показана доля правильно отредактированных участков, серым — ошибочно отредактированные куски. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Авторы проверили свою новую технику на всех видах точечных мутаций, а также на более крупных вставках (до 44 пар оснований) и делециях (до 80 пар оснований). Они подсчитали, что их метод сможет исправить примерно 89% известных генетических вариантов, связанных с заболеваниями, — именно столько генетических патологий из базы данных ClinVar лечится относительно короткими изменениями ДНК (в пределах 30 нуклеотидов).

В целом, новый метод выглядит очень перспективно, хоть, разумеется, и требует проверки другими исследователями. В отличие от CRISPR/Cas9 он не делегирует починку ДНК неряшливой системе репарации клетки, а разрезает всего одну цепь ДНК и сам же ее достраивает. Самостоятельно клетка чинит разрыв только на последней стадии редактирования, но это гораздо безопаснее, чем починка двухцепочечного разрыва: тут задействована другая, гораздо более аккуратная система репарации, которая следует указанию белкового комплекса, любезно указывающего ей на неправильную цепь.

Источник: elementy.ru

Fozzy

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here

восемь − шесть =